BioDigital·青| 可以兼容qPCR體系的dPCR平臺(tái)

更新時(shí)間：2023-02-15 點(diǎn)擊次數(shù)：1394

新冠疫情爆發(fā)以來，熒光定量PCR（qPCR）的核酸檢測(cè)已經(jīng)成為新冠確診的“金標(biāo)準(zhǔn)"。與免疫檢測(cè)相比熒光定量PCR具有較高的靈敏度，檢測(cè)窗口期較短，可以更早地確診是否病毒感染。qPCR是如何實(shí)現(xiàn)新冠定量的？首先，從咽拭子/鼻拭子中抽提獲得新冠的遺傳物質(zhì)RNA，然后通過qPCR儀定量出拭子中的RNA病毒載量，就可以確定是否是新冠感染者。

熒光定量PCR技術(shù)最主要的參數(shù)是擴(kuò)增曲線的ct值，該值與被定量樣本的濃度存在一定數(shù)學(xué)關(guān)系，在qPCR定量中樣本的濃度對(duì)數(shù)值（log值）與擴(kuò)增曲線的ct值呈線性關(guān)系，ct值越小，濃度越高。根據(jù)采用的定量數(shù)學(xué)模型的差異，qPCR的定量分為外標(biāo)定量（外標(biāo)法）和內(nèi)標(biāo)定量（內(nèi)標(biāo)法）兩種。外標(biāo)法是定量過程中需要使用一系列已知濃度的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)品（4-5個(gè)濃度梯度），與待檢測(cè)的樣本同時(shí)檢測(cè)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待檢測(cè)的樣本，該方法用的較多。內(nèi)標(biāo)定量指已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（即定量?jī)?nèi)標(biāo)，1個(gè)濃度）,與待檢測(cè)的樣本在同一管內(nèi)擴(kuò)增檢測(cè)，需要保證內(nèi)標(biāo)與檢測(cè)樣本的擴(kuò)增效率一致，才能準(zhǔn)確計(jì)算出待檢樣本的濃度。

qPCR外標(biāo)定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

需要做標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋，浪費(fèi)5-10個(gè)反應(yīng)孔做標(biāo)準(zhǔn)曲線，需同時(shí)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測(cè)的樣本。

1）標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本同時(shí)擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

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圖1.外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2）數(shù)據(jù)分析

需要繁瑣的數(shù)據(jù)整理，將待檢樣本的ct值代入標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知樣本的濃度。

無論是外標(biāo)定量，還是內(nèi)標(biāo)定量，qPCR技術(shù)的定量均需要采用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來實(shí)現(xiàn)未知濃度樣本的定量。然而，在實(shí)際情況中標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的性質(zhì)不會(huì)相同，很難保證待檢樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率達(dá)到一致。所以，qPCR定量的精準(zhǔn)性會(huì)打折。盡管qPCR具有比免疫檢測(cè)技術(shù)更高的靈敏度，從新冠疫情的檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，qPCR技術(shù)需要做2-3次重復(fù)檢測(cè)，也會(huì)有一些無癥狀感染者轉(zhuǎn)陽的案例，都是因?yàn)閝PCR技術(shù)的靈敏度相對(duì)較低導(dǎo)致的。

外標(biāo)法

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內(nèi)標(biāo)法

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圖2.熒光定量PCR定量方法

數(shù)字PCR技術(shù)（dPCR）是一種核酸絕對(duì)定量技術(shù)，將反應(yīng)體系均勻分配至2萬個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)微孔中，每個(gè)單元包含0個(gè)、1個(gè)、個(gè)別有多個(gè)目標(biāo)核酸分子，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束之后依據(jù)泊松分布原理對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元熒光信號(hào)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。

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圖3.數(shù)字PCR熒光信號(hào)

紅黃藍(lán)綠各代表不同的檢測(cè)靶標(biāo)，同一張芯片可以檢測(cè)多種靶點(diǎn)

相比傳統(tǒng)熒光定量PCR，數(shù)字PCR擁有高的檢測(cè)靈敏度（是熒光定量PCR的100倍以上，降低了“漏檢"風(fēng)險(xiǎn)）、特異性和精確性，并且無需標(biāo)準(zhǔn)品可實(shí)現(xiàn)定量，是真正的絕對(duì)定量技術(shù)。

數(shù)字PCR平臺(tái)定量

1）無需標(biāo)準(zhǔn)品，只需擴(kuò)增檢測(cè)未知樣本即可。

2）數(shù)據(jù)分析可視化的圖片，無需數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，直接呈現(xiàn)待檢樣本的濃度（copies/μL）。

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qPCR和dPCR的差異主要在于是否需要分區(qū)檢測(cè)。qPCR不需要分區(qū)檢測(cè)，20μL反應(yīng)體積中包含待檢測(cè)的靶標(biāo)分子和反應(yīng)試劑，該反應(yīng)體系置于200μL的PCR反應(yīng)管中擴(kuò)增檢測(cè)信號(hào)；dPCR需要將20μL的反應(yīng)體積（包含待檢分子和反應(yīng)試劑）分到2萬多個(gè)體積只有1nL左右的微反應(yīng)單元，實(shí)現(xiàn)數(shù)字化分割。數(shù)字PCR的分區(qū)擴(kuò)增提高了PCR檢測(cè)靈敏度和精準(zhǔn)性。

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表1.數(shù)字PCR與熒光PCR對(duì)比

那么，如何將qPCR體系轉(zhuǎn)移到dPCR平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)PCR檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性和靈敏度？從檢測(cè)原理上看dPCR的分區(qū)擴(kuò)增保證了PCR檢測(cè)的靈敏度和精準(zhǔn)性，而qPCR可以通過加大待檢樣本的體積來提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，但是這種方法提高的靈敏度和特異性是有限的。目前，qPCR已經(jīng)有大量成熟的檢測(cè)試劑盒（包括科研、醫(yī)療等），而dPCR技術(shù)具有更高的檢測(cè)靈敏度和精準(zhǔn)性，如果把目前qPCR檢測(cè)體系轉(zhuǎn)移到dPCR平臺(tái)就可以更快地實(shí)現(xiàn)PCR檢測(cè)的靈敏度和精準(zhǔn)性。

實(shí)現(xiàn)該方法的轉(zhuǎn)移需要滿足3個(gè)條件：

1）qPCR試劑盒發(fā)光原理和dPCR檢測(cè)的原理一樣；

2）dPCR平臺(tái)開放，兼容第三方的試劑盒或者試劑；

3）適度的體系優(yōu)化即可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。

qPCR體系轉(zhuǎn)移到dPCR平臺(tái)會(huì)帶來2大優(yōu)勢(shì)：

1）不需要標(biāo)準(zhǔn)品，既可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量；

2）提高了qPCR試劑盒檢測(cè)的靈敏度和精準(zhǔn)性。

BioDigital數(shù)字PCR“三明治"芯片，采用玻璃基底的微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)樣本的穩(wěn)定分區(qū)，保證了每個(gè)液滴的獨(dú)立性和穩(wěn)定性，具有更高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。另外，BioDigital數(shù)字PCR平臺(tái)具有很好的開放性，支持第三方qPCR試劑盒或試劑的轉(zhuǎn)移，通過一步簡(jiǎn)單的體系優(yōu)化甚至不需要優(yōu)化的情況下，qPCR試劑盒就可以在BioDigital平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定量。

#案例一

小海龜科技BioDigital數(shù)字PCR平臺(tái)兼容性測(cè)試——兼容客戶自由的試劑盒、平臺(tái)開放

測(cè)試內(nèi)容：使用A客戶自有體系（包括檢測(cè)緩沖液、引物探針和模板）搭配小海龜數(shù)字PCR平臺(tái)進(jìn)行測(cè)試；

測(cè)試目的：使用客戶成熟的熒光定量/數(shù)字PCR檢測(cè)體系，測(cè)試其與小海龜數(shù)字PCR平臺(tái)的兼容性，協(xié)助客戶將檢測(cè)體系遷移至我們的平臺(tái)，節(jié)省體系重新開發(fā)的成本；

測(cè)試結(jié)果：重復(fù)8次測(cè)試（包括陰性和陽性），平均有效液滴數(shù)19000+，表明客戶體系與小海龜數(shù)字PCR平臺(tái)可兼容，液滴生成未受影響；下圖為測(cè)試結(jié)果（原始圖和一維散點(diǎn)圖），結(jié)果表明數(shù)字PCR腔室分割正常，陽性液滴分布均勻，一維散點(diǎn)圖陰陽性界限明顯。

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#案例二

小海龜科技多重?zé)晒?、低檢出限、梯度稀釋驗(yàn)證

測(cè)試內(nèi)容：使用小海龜數(shù)字PCR通用試劑盒，結(jié)合B客戶自建的檢測(cè)體系（引物探針）對(duì)小海龜數(shù)字PCR平臺(tái)進(jìn)行測(cè)試驗(yàn)證；

測(cè)試目的：測(cè)試B客戶自建體系與平臺(tái)的兼容性，并驗(yàn)證平臺(tái)檢測(cè)性能（線性、低檢出限等）；

測(cè)試結(jié)果：客戶自建引物探針體系可兼容小海龜數(shù)字PCR平臺(tái)，多重PCR體系陰陽性分簇良好。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，小海龜數(shù)字PCR平臺(tái)在1-1000copies/μL濃度范圍內(nèi)線性度佳（R2=0.999947），低檢出限可達(dá)1copies/μL。

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